استخلاص الــ DNA بالطريقة اليدوية
- كسر وفتح الخلايا لتحرير محتويات الخلايا
والحامض النووي .
- ازالة محتويات الخلايا وتجميع وتنقية الحامض النووي .
1- يتم طحن
العينة النباتية باستخدام Liquid Nitrogen مع مراعاة
ان يكون الطحن جيداً ولا يوجد أي تكتلات بحيث تكون العينة علي هيئة بودر.
2- يتم اخذ 0.2 – 0.5 جم من العينة المطحونة وتوضع في eppendorf
ويوضع عليها محلول الاستخلاص.
تركيب محلول الاستخلاص ( لتحضير 100 مليلتر )
يضاف الي 70 مل من الماء المقطر ما يلي :
أ-
200
مليجرام بوتاسيوم ايثيل زانثوجنات
o لديه القدرة علي اذابة السيليلوز الموجود فى
جدر الخلايا حيث يتفاعل مع مجاميع الهيدروكسيل لعديد السكريات مكونا معقد ( زانثات
عديد السكريات ) وهذا المعقد يذوب في الماء مما يسهل تحليل الخلايا بواسطة
المنظفات .
o لدية القدرة علي ال الاتحاد مع مجاميع
الامين الموجودة في البروتين وRNA مكونا مركبات غير ذائبة
يمكن ترسيبها والتخلص منها باستخدام الطرد المركزي
o لا يتفاعل مع الـــ DNA .
ب
- 10مليلتر من محلول 1 مولر Tris PH=8
- يعمل كمحلول منظم لظبط ال ph عند 8 والحفاظ عليها .
حيث انه اذا قلت درجة ال ph عن 5 يؤدي ذلك الي نزع وحدات البيورين الموجودة في الــ DNA المراد عزلة وبالتالي يؤدي الي فقدانه.
اما اذا زادت الـ ph عن 12 يؤدي ذلك الي كسر الروابط الهيدروجينية الموجودة بين خيطي
الــ DNA
وتحويلها الي شرائط مفردة مما يؤدي الي فقدانها ايضا.
جـ-
2 مليلتر من محلول 0.5 مولر EDTA
-
هذة المادة المخلبية لديها القدرة علي نزع ايونات الماغنسيوم التي لديها دور كبير
في ثبات الجدار الخلوي.
- تثبيط مفعول معظم الانزيمات الموجودة في
الخلية ولعل اهم هذة الانزيمات هو انزيم الــ DNase الذي يكسر الــ DNA
ويمكن ايضا في هذة المرحلة استخدام مادة SDS
لقدرتها علي اذابة الدهون الموجودة في الجدار الخلوي فتعمل علي تكسيره .
د
- 4 جم Nacl
- يساعد علي تحليل الجدار الخلوي كما انه
يعمل ايضا علي استمرارية ذوبان الـSDS
في الايثانول اثناء ترسيب الـ DNA .
3-
يتم وضع الانبوبة التي تحتوي علي العينة + محلول للاستخلاص في حمام مائي علي
درجة 65مئوي لمدة 30-40 دقيقة وذلك بعد رجها جيدا لضمان
الاختلاط الجيد مع محلول الاستخلاص , وكذلك يراعي رجها بحرص علي فترات وذلك اثناء
فترة التحضين.
4- اجراء طرد مركزي لمدة 15 دقائق علي سرعة
12000 لفة في الدقيقة وذلك للتخلص من الفضلات الغير ذائبة .
5-
يتم نقل الجزء الرائق (( Supernatant فقط الي انبوبة جديدة واهمال الراسب.
6- يتم اضافة نفس حجم
السائل الموجود بالانبوبة من مادة "الفينول – كلورفورم – ايزواميل" ثم
رج الانبوبة جيدا ثم اجراء طرد مركزي لمدة 15 دقائق علي سرعة 12000 لفة وتعتبرهذه
الطريقة المثلى لازالة أكبر قدر من البروتين.
7- من المرحلة السابقة
سوف يتكون طوران منفصلان الطور العلوي هو المائي ( الذي يحتوي علي الـ (DNA اما
الطور السفلي هو الفينول بينما البروتين يترسب عند السطح الفاصل بينهم . وفي هذة
المرحلة يتم نقل الطور العلوي ( المائي ) بحرص شديد دون الاقتراب من الطبقة الوسطي
الي انبوبة جديدة.
8- يتم اضافة حجم مماثل من الايثانول 95% ثم
الخلط جيداً عن طريق الرج بحرص عدة مرات وبنهاية هذة المرحلة من المحتمل ظهور خيوط
رفيعة جداً.
9- يتم تجميع الـ DNA المترسب ( (Peltبواسطة
الطرد المركزي لمدة5 دقائق علي 12000 لفه ثم يتم استبعاد الايثانول وتترك العينة
لتجف.
10- يعاد ذوبان راسب الـ DNA
المتكون في 300 ميكروليتر من محلول TE المنظم(10mM
EDTA PH=8 و 1 Mm Tris)
لتحضير 100 مليلتر يحضر كالتالي: الي 70 مل من الماء المقطر المعقم يضاف الاتي:
- 1 مليلتر من محلول 1 مولر TrisPH=8
- 200ميكروليتر
من محلول 0.5 مولر EDTA
ثم نكمل الحجم الي 100 مل ويرج جيدا ويعقم
في الاوتوكلاف.
11- بعد اذابة ال DNA
في TE يتم اضافة 10 ميكروليتر من انزيم الـ RNase والخلط جيداً ثم توضع الانبوبة في حمام مائي علي درجة حرارة 37
مئوي لمدة 30 دقيقة.
12 – اضف 150 ميكروليتر
من محلول خلات الامونيوم 7.5 مولر مع الرج
"عند الأهمية "
13- اضف 900 ميكروليتر من
ايثانول 95% واخلط جيداً عن طريق قلب الانبوبة عدة مرات
14- يتم اجراء طرد مركزي
لمدة 10 دقائق علي 12000 لفة " في هذة المرحلة سوف يترسب الـ DNA في قاع الانبوبة " بعد ذلك يتم التخلص من الايثانول مع
الحفاظ علي الـ DNA
المترسب .
15- يتم اجراء غسيل للـ DNA المترسب باستخدام ايثانول 70% ثم يتم اجراء طرد مركزي مرة اخري
والتخلص من الايثانول .
16- يتم اذابة الـ DNA المترسب باستخدام 100 ميكروليتر من الماء المقطر
المعقم او في محلول TE المنظم ثم يوضع في حمام مائي لمدة 10-20
دقيقة .
اصبح الان لديك
DNA نقي وجاهز للاستخدام في التجارب العلمية
ملاحظات هامة:
يلعب
الايثانول دورا هاما فى كشف الغلاف المائى من الأحماض النووية مما يؤدى الى كشف
الشحنات السالبة الخاصة بمجاميع الفوسفات المكونة للDNA
ومن ثم لابد من وجود مصدر للكاتيونات الموجبة مثل خلات
الأمونيوم حتى تتمكن الكاتيونات الموجبة من الارتباط بالشحنات السالبة وتقوم
بمعادلتها كهربيا فيترسب الDNA
كيف يمكن تحضير محلول 1 مولر ؟
الوزن
الجزيئى الجرامى Gram Molecular Weight أو
الكتلة المولارية أو الوزن المولارى (Molar
Weight) يمكن تعريفه على انه مجموع الأوزان الذرية
بالجرام لجميع الذرات الداخلة فى تكوين الصيغة الجزيئية للمركب
مثال
هيدروكسيد الصوديم NaOH
Na=
22.99 H=1 O=16
NaOH=22.99+16+1=40
فعند
اذابة 40 جرام من مادة هيدروكسيد الصوديم فى 1 لتر من الماء يعطى 1 مولر
ليست هناك تعليقات