تقنية PCR Polymerase Chain Reaction تفاعل البوليمريز المتسلسل

تقنية PCR

Polymerase Chain Reaction

تفاعل البوليمريز المتسلسل

توصل العالم  Dr. Kerry Mullis  وزملاؤه بكاليفورنيا في عام 1985  بنشر اختراعه لتقنية الـ بي سي ار PCR فكانت هذه التقنية بوابة لكثير من التطورات المتسارعة في مجال التكنولوجيا الحيوية ، من أهم الأسباب التي ساعدت هذه التقنية على الانتشار عدم اعتمادها على النظام الحيوي ( أي الخلية ) و التحكم بكمية الحمض النووي (DNA) وسرعة في الإنتاج ولكن كان من عيوب هذه التقنية عدم وجود نظام إصلاح أخطاء الارتباط الخاطئ miss match.

ما هو PCR  : هو تقنية معملية تم اكتشافها عام 1983م  تقريباً تقوم على إكثار نسخ الحمض النووي (DNA ) خارج النظام الحيوي . أي أنها طريقة لنسخ الحمض النووي في المعمل. ولذلك فهي تقنية حيوية لاستنساخ قطعة محددة من الحمض النووي DNA ومضاعفة إنتاجها  لكي يتسنى إجرى عليه اختبارات و فحوصات إضافية.

 ما هي متطلبات PCR  : لقيام بإنتاج الحمض النووي (DNA )  بواسطة PCR يتطلب توفير :

1. نظام حرارى مناسب .للتحكم بدرجات حرارة التفاعل بشكل دقيق و متتالي  ( الدورة الحرارية Thermo-cycle ) ، ويقوم هذا الجهاز بتغير درجة الحرارة بشكل سريع ، لآن تغير درجة الحرارة هو الأساس الذي تقوم عليه فكرة هذه التقنية .

2.إنزيم البوليمريز : وهو الإنزيم الذي يقوم ببناء وترتيب القواعد النيتروجينية  ( وحدات الحمض النووي DNA ) ، ويجب أن يكون هذا الإنزيم مقاوم للحرارة العالية ليتمكن من العمل. وقد اكتشف انزيم مقاوم للحرارة وهو Taq DNA polymerase .

3. القواعد النيتروجينية dNTPs : ( A T C G ) ليتمكن الإنزيم من ترتيبها في مواقعها أثناء عملية نسخ الحمض النووي DNA .

4بادىء Primer : وهو قطعة صغيرة من الحمض النووي DNA ليتمكن الإنزيم من  بداء البناء  و النسخ  عليها .

5.  تخليق جديلتين من ال DNA مفرد الخيط 

6.  محلول منظم مناسب للتحكم فى درجة الحموضة و القلوية لوسط التفاعل

 عملية النسخ :

بعد وضع الحمض النووي المراد نسخة  مع البريمر وإنزيم  البوليمريز ومجموعة من القواعد النيتروجينية dNTPs في أنبوب الاختبار داخل جهازالتحكم الحراري فان هناك 3 مراحل منفصلة  تمر بها عملية النسخ:

1. مرحلة الدنترة Denaturation  : رفع الحرارة إلى (94- 95 ْم ) وذلك لفك حلزنة الحمض النووي DNA وكذلك الـ DNA  المزدوج يصبح مفرد من خلال تكسير الروابط الهيدروجينية بين شريطى الDNA.

2. مرحلة إرتباط البادىء   annealing :  إنخفاض الحرارة إلى ما بين ( 45-65 ْم )  ليقوم البريمر بالأرتباط فيزيائياً بواسطة الروابط الهيدروجينية مع الحمض النووي DNA الأصل .حيث أن كل بادئ لة درجة الحرارة الخاصة بة AT = 2(A+T) +4(G+C)

3. مرحلة الإستطالة  extension : رفع درجة الحرارة إلى 72 ْم ليقوم البوليمريز بعمله في بناء الحمض النووي DNA الجديد وذلك بإضافة القواعد النيتروجينية إلى النهاية 3OH الموجودة في نهاية البادئ المرتبط بال DNA .

وهذه المراحل الثلاث تعتبر دورة كاملة وفيها يصبح الحمض النووي DNA  الأصل قد تضاعف ، وتعتمد كمية ناتج الحمض النووي DNA على عدد الدورات ( والصورة التالية  توضح العملية ) .

 

تطبيقات PCR :

لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA )  و الوراثة ومنها :

1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele ) .

2. تعين البصمة الوراثية .                  3. الكشف عن الفيروسات

4. عملية التجميع الجيني ( Recombinant DNA  ) : حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .

5.استخدامه في تغير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع إنزيمات القطع (Restriction enzyme) 

6. تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA )  (Sequencer DNA   ) .

7. معرفة طول الحمض النووي (DNA ) . 8.  تقنية الحمض النووي (DNA )   المكمل (cDNA) .

9.  تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات . 10.   يستخدم في تقنية (microarrays  ).

11.  في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project  ) .

12.  Southern plot .                 13.  تقنية ( DNA - Protein Interaction ) .

14.  في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات الاغتصاب ، تحديد الهوية ... الخ ) .

وغيرها من التطبيقات المعملية والبحثية .

 أنواع PCR : هناك نوعان من PCR :

1.  PCR العادي: وهو ما تم شرحه والتطرق اليه في الخطوات السابقة.

2.  rtPCR: وهو اختصار لـ ( Real Time PCR ) : وهذا النوع يقوم على نفس المبدأ ولكن الخلاف الوحيد يكون مربتط الجهاز بكمبيوتر لتحديد الوقت الحقيقي لبدا التفاعل ومن ثم الكمية الحقيقية لعدد نسخ الحمض النووي (DNA )  ويعتمد ذلك على وجود قواعد نيتروجينية حرة مشعة لتحديد ذلك . مما يسهل على الباحثين الوقت لتحدد وجود الجين المطلوب أو لا ، وكمية الجين بدون الوصول إلى نهاية الدورات الحرارية المحددة

الفصل علي الجيل بالكهرباء

فصل قطع الـ DNA على لوح من الجيل بالكهرباء :   ( Gel Electrophoresis)

 استعمل العلماء تقنية فصل البروتينات عن بعضها البعض بطريق انتقالها وانفصالها عن بعضها البعض ، و ذلك  عن طريق تعريضها إلى تيار كهربائي وهي على لوح من المادة الهلامية المعروفة بالجيل . ولقد استعمل العلماء نفس الفكرة  في فصل قطع الـ DNAعن بعضها البعض . ومن المعروف أن الحمض النووي عبارة عن شحنة سالبة و لذلك فعند و ضع بعض من الـ DNA في طرف من أطراف لوح الجيل ثم وتعريضها لتيار كهربائي بحيث يكون القطب السالب عند الطرف الذي وضعنا فيه الـ DNA والقطب الموجب عن الطرف الأخير من ألواح فان الـ DNA ينتقل تلقائيا بتجاه الطرف الذي فيه القطب الموجب و تتوقف حركة قطع الـ DNA على حسب إحجامها على طول اللوح . فالقطع الصغيرة تتحرك بشكل اكبر من القطع الكبيرة. وبذلك يمكن فصل هذه القطع عن بعضها البعض . و يمكن تحديد الحجم الفعلي لكل قطعة عن طريق إضافة قطع معروفة الحجم من الـ DNA والتي تكون مقياس يرجع إليه لاستنتاج أحجام القطع.

وهناك نوعان أساسيان من ألواح الجيل. الأول يسمى بجيل الاجروز (Agarose gel ) والثاني بجيل البولي اكريليميد (Polyacrylamide gel ) ونظرا لصغر الفراغات التي بين البولي اكريليميد فانه يستخدم لفصل القطع الصغيرة الحجم من DNA وفي العادة التي تكون اصغر من 500 جزيء من الحمض النووي والتي تتفاوت بين بعضها البعض بجزيء أو جزيئين (انظر الرسم A) ، بينما يستخدم الاجروز للأحجام الأكبر من DNA والتي يتراوح حجمها بين 300 إلى 10000 جزيء من الـ DNA (انظر الرسم B) .ومادة الاجروز هي مادة سكرية مستخرجة من الطحالب وعند تحضيرها فإنها تشبه في قوامها الجيلاتين الذي نأكله ولكنها أقوى في قوامها بعض الشيء و لكنها قابلة للتهتك أو الانقطاع عند نقلها بغير حرص ولقد واجهه العلماء صعوبات في فصل القطع الكبيرة من الـ DNA وذلك لان هذه القطع وعند وضعها على جيل الاجروز وبعد تسليط التيار الكهربائي عليها تتوقف لأنها تتمدد بشكل متعرج على شكل ثعبان ملتوي طرف باتجاه القطب السالب والأخر بتجاه القطب الموجب. ولقد حلت هذه المشكلة عن طريق تعريض جل الاجروز إلى مستويات متفاوتة من القوة الكهربائية على طول اللوح وبذلك فان قطعة الـ DNA الطويلة عندما تتعرض إلى تيار كهربائي مختلف يجعلها تعدل من تمددها المتعرج  قبل أن تدخل في التيار الكهربائي الجديد و يستمر هذا التفاوت في التيار والتعديل في قوام القطعة حتى تصل إلى المكان الذي يجب أن تقف فيه حسب حجمها. و يسمى هذا النوع من الفصل بالفصل عن طريق المجال الكهربائي المتردد (Pulsed-field gel electrophoresis ). وأمكنت هذه التقنية من فصل قطع كبيرة من الـ DNA وحتى فصل قطع من الكروموسومات على الجيل و تتراوح القطع التي يمكن فصلها بهذه الطريقة بين 220000 إلى 2.5 مليون جزيء من الـ DNA (انظر الرسم C).

لاتكون القطع المفصولة بالبولي اكريليميد والاجروز واضحة للعيان و لذلك فان لوح الجيل يعرض إلى مادة لصباغة الـ DNA واشهر هذه المواد هو مادة برميدات الاثيديوم (  Ethidium Bromide ) والتي تلمع عند تعريضها للأشعة فوق البنفسجية. وهناك طريقه أكثر دقه لمشاهدة القطع على لوح الجيل و هذه الطريقة تعتمد على إضافة مادة مشعة نووية إلى الـ DNA قبل أن يوضع على لوح الجيل و لكن هذه الطريقة تحتاج إلى احتياطيات معينه لكي لا تضر بمن يستخدمها.